【动科前言】分离纯化试剂对鸡球虫卵囊孢子化的影响

中农威特生物科技股份有限公司2018-06-19 13:15:44

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分离纯化试剂对鸡球虫卵囊

孢子化的影响

摘要:饱和食盐水和次氯酸钠溶液,是鸡球虫卵囊收集与纯化主要常用试剂。为满足鸡球虫病活卵囊疫苗生产工艺需求,本研究分别将鸡球虫卵囊置于饱和食盐水和次氯酸钠溶液中进行处理,再进行孢子化培养,以确定上述两种试剂及不同处理时间对鸡球虫卵囊孢子化的影响。试验结果表明,鸡球虫卵囊在饱和食盐水和次氯酸钠溶液中的处理时间均应控制在30 min内。在此时间内,卵囊孢子化影响率不超过5%。

关键词:饱和食盐水  次氯酸钠  鸡球虫卵囊  孢子化

图1 雏鸡感染急性球虫病死亡

小肠中断严重出血或者被损害肠段浆膜有多亮淡白色斑点

文献报道中的可用作鸡球虫卵囊漂浮液的试剂包括硫酸盐(钠、锰、铵、镁)、氢氧化钠、硫代硫酸钠、氯化钠、蔗糖等。

目前,粪便中鸡球虫卵囊的收集纯化,无论是在实验室还是在鸡球虫病活卵囊疫苗生产中,均以饱和食盐水漂浮为主,也是最经典的方法。

次氯酸钠溶液是一种强氧化剂,在鸡球虫卵囊分离与纯化中应用广泛,尤其在肠道内卵囊分离与纯化时,不仅能起到很好的消化作用,使鸡球虫卵囊更加充分释放,并去除杂质,而且还能杀灭肠道内的细菌微生物,极大地提高鸡球虫卵囊的纯净度。

在实验室研究中,鸡粪通过饱和食盐水漂浮沉淀法和次氯酸钠溶液处理后,均能获得纯度相对较高的鸡球虫卵囊(如图2)。

图2 经饱和食盐水漂浮沉淀和次氯酸钠溶液处理后,获得的高纯度鸡球虫卵囊

一般认为,盐类漂浮液会对鸡球虫卵囊会造成一定的损伤,经长时间处理,会一定程度降低卵囊的孢子化率,但缺少相关实验数据。鉴于此,本研究对饱和食盐水和次氯酸钠溶液的不同处理时间,对鸡球虫卵囊孢子化的影响进行了研究。

材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 试验动物与饲料

       1日龄黄羽肉鸡,购自兰州本地鸡苗供应商(鸡苗来源于广东智威农业科技股份有限公司),饲养于无鸡球虫污染笼舍内,按肉鸡饲养标准(鸡饲养标准NY/T 33-2004)饲养。

       饲料为不含任何抗球虫药物肉小鸡全价料,购自兰州养动力饲料有限公司。

1.1.2 虫种

        柔嫩艾美耳球虫玉林株,由中农威特生物科技股份有限公司分离鉴定、保管贮存。

1.1.3 主要试剂

精制食盐(中盐公司);

次氯酸钠溶液:≥10.0%,天津百世化工;

饱和食盐水配制:2 L纯水煮沸后,缓慢加入食盐,并不停搅拌,待食盐不再溶解后停止加热和搅拌,冷却后收集于2 L锥形瓶中备用。

1.1.4主要设备

      不锈钢标准筛(100目、200目)、低速大容量离心机(LXJ-IIB,上海安亭)、恒温振荡培养箱(RS-RDV1,美国精骐)。

1.2 方法

1.2.1 接种感染

      5只14日龄黄羽雏鸡,每只鸡分别经口接种柔嫩艾美耳球虫玉林株孢子化卵囊5 ×104个。

1.2.2 卵囊收集

      接种后168 h,剖杀所有鸡只,收集双侧盲肠,纵向剪开,刮取肠道内容物和粘膜层。刮取物加入100 mL纯水中,充分搅拌混匀后经100目和200目不锈钢筛过滤,收集滤液,滤液中含新鲜柔嫩艾美耳鸡球虫卵囊。

图3 艾美耳球虫感染的鸡小肠中断

浆膜可见白色、坏死小点和出血点。肠壁扩张、增厚、肠道含有黄色、稀薄内容物

1.2.3 饱和食盐水和次氯酸钠处理

准备9根洁净的50 mL离心管,编号分别为1~9,各管分别加入10 mL卵囊滤液,离心(3000 rpm, 10 min),弃上清。

1号离心管的卵囊沉淀,直接用50 mL 2.5%重铬酸钾溶液重悬后移至另一洁净的250 mL锥形瓶中,锡箔纸封口后于28 ℃恒温培养箱振荡(120 rpm)培养。

2~5号离心管中分别加入10 mL饱和食盐水,6~9号离心管中分别加入15%次氯酸钠溶液(v/v)10 mL,充分重悬混匀。分别于10、30、60、120 min后各取1管上述两种试剂处理的卵囊悬液,分别加入40 mL纯水混匀,离心(3000 rpm,10 min),沉淀用30 mL纯水重悬后再次离心去除剩余试剂。各管沉淀分别用50 mL 2.5%重铬酸钾溶液重悬,分别移至另一洁净的250 mL锥形瓶中,锡箔纸封口后于28 ℃恒温培养箱振荡(120 rpm)培养。

1.2.4 孢子化率计算

       培养48 h后,用血细胞计数板对未处理组和各试验组卵囊,进行未孢子化卵囊量和孢子化卵囊量计数,并计算孢子化率。

孢子化率计算公式为:

(孢子化卵囊总量/(孢子卵囊总量+未孢子化卵囊总量)×100%

结果与分析

通过计算饱和食盐水和次氯酸钠溶液不同时间处理后的鸡球虫卵囊孢子化率,结果显示,饱和食盐水处理10min、30min、60min和120 min的鸡球虫卵囊,较未处理组鸡球虫卵囊孢子化率分别下降了1.67%、4.03%、6.11%和17.3%(见表1);15%次氯酸钠溶液(v/v)处理10min、30min、60min和120 min的鸡球虫卵囊,较未处理组鸡球虫卵囊孢子化率分别下降了0.94%、4.97%、6.65%和9.38%(见表2)。

结果表明,饱和食盐水和次氯酸钠溶液处理鸡球虫卵囊时间,不宜超过30 min,处理时间超过30 min,这两种试剂造成的鸡球虫卵囊孢子化下降率将超过5%。

表1 饱和食盐水不同处理时间对

鸡球虫卵囊孢子化率的影响

表2 次氯酸钠溶液不同处理时间对

鸡球虫卵囊孢子化率的影响

讨论

鸡球虫的未孢子化卵囊不具有感染性。鸡球虫病活卵囊疫苗中未孢子化卵囊比例过高,将直接影响鸡球虫病活卵囊疫苗的质量。因此,卵囊的孢子化率是提高疫苗质量、降低生产成本等需重点解决的问题,同时也是鸡球虫病活卵囊疫苗生产操作规程和质量标准的重要检测指标,如现有鸡球虫病活卵囊疫苗国家质量标准中,规定的卵囊孢子化率应不低于80%。

有研究认为,除糖类溶液外,盐类漂浮液会对卵囊造成一定的损伤,长时间处理鸡球虫卵囊将一定程度降低卵囊的孢子化率。本研究结果亦表明,饱和食盐水处理鸡球虫卵囊时间不宜超过30 min。同时,次氯酸钠溶液处理的时间亦不宜过长,应同样控制在30 min以内。

本研究对饱和食盐水以及次氯酸钠溶液不同处理时间,对鸡球虫卵囊孢子化的影响进行了试验,完善了相关试验数据,可供生产和科研参考,无论科研人员还是生产人员,均应严格按照鸡球虫学实验操作步骤和生产操作规程进行操作,以免对鸡球虫卵囊造成损伤而降低其孢子化率。

小结

卵囊在饱和食盐水和次氯酸钠溶液中的处理时间应控制在30 min内,在此时间内,卵囊孢子化影响率不超过5%。

(参考文献略)

东城项目办 | 魏红梅 常 芳  

编审 | 李克斌

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噬菌体的研究进展

一提到病毒,人们常会联想到致病源。常见的病毒大多能够引发机体感染,导致生理机能紊乱。而今天要提到的这种“神奇”的病毒却是一类能够治愈某些细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物感染的“灵丹妙药”,我们称它为“噬菌体”或者“细菌病毒”。早在20世纪初,就有学者发现了这种能够杀灭细菌的 “活性物质”的存在,并提出噬菌体疗法,在一段时期内噬菌体成为在抗生素时代之前对抗细菌感染的重要武器之一。但随着抗生素的出现,关于噬菌体的研究也越来越不受重视,直到近几年细菌耐药性的问题,尤其是“超级细菌”的出现,噬菌体的研究才重新回到人们的视野。

1 噬菌体结构示意图

噬菌体的发现

噬菌体的发现要追溯到1896年,英国家Hankin对Ganges河流中的霍乱弧菌的计数时,发现在Agra城市的入口和出口处河水中霍乱弧菌的数量相差悬殊,其认为河水中存在某种抗菌物质。随后一短时间,纷纷有学着报道发现细菌被裂解的现象或有裂菌斑产生。直到1917年,D'Herelle认为,裂菌斑是由病毒感染细菌所致,并正式提出“噬菌体”这一概念。

噬菌体的分类

噬菌体是一种“特殊”的病毒,它是一类以细菌为宿主的病毒。噬菌体以其种类多,数量大,生命力顽强等特点广泛存活于各种生态环境中。几乎所有有细菌的地方,都能找到噬菌体的存在。噬菌体按与宿主的关系可以分为烈性噬菌体和温和噬菌体噬菌体,前者在宿主细胞内能够复制增殖并使宿主细胞裂解,具有临床治疗价值;后者进入宿主内并不单独进行增值或不引起溶菌,两者的增殖区别在第三部分噬菌体的繁殖中可见。如果根据蛋白质结构和核酸种类组成可以进行以下分类。(表1)

表1 噬菌体分类

目前发现的噬菌体大概有2850种(株),其中有2700种(株)是有尾的,大肠杆菌噬菌体是发现的最多,也是研究得最深入的一种宿主。其中具有代表性的是T4噬菌体,具有典型的蝌蚪状外形,由头部和尾部组成。头部的外部呈二十面体结构,蛋白质壳体的内部包裹着折叠的DNA分子,尾部由不同于头部的蛋白质组成。形成一个中空的长管结构,外面包裹的尾鞘具有收缩的功能。

噬菌体的繁殖

噬菌体的繁殖与所有病毒一致,都需要依赖其他生物的细胞来实现增殖的过程。有所不同的是,噬菌体仅依赖细菌或者说是仅依赖原核生物为载体。他们的繁殖过程大致分为五个阶段:吸附(目标)-侵入(目标)-(基因)复制与(蛋白)合成-成熟(装配)-裂解释放。

图2 噬菌体的增殖过程(摘选)

吸附:噬菌体感染宿主细胞的第一步就是“吸附”。噬菌体的尾丝尖端能与宿主细胞细胞壁上的特异性受体结合,使噬菌体吸附在宿主细胞表面。

侵入:噬菌体的尾管能够释放少量的溶菌酶,破坏宿主的细胞壁,尾鞘蛋白收缩使尾管得以通过缺口伸入细胞壁内部,随后将头部的DNA注入宿主的细胞内进行增殖。

复制与合成:裂解性噬菌体DNA进入宿主细胞后,在抑制宿主DNA合成的同时,还能有效利用宿主细胞,进行子代噬菌体DNA的复制和蛋白质合成,最终形成完整的噬菌体颗粒;溶源性噬菌体在复制与合成阶段略晚一些,当溶源性噬菌体头部DNA注入宿主细胞内后会有一段休眠期,其遗传物质会与细菌的遗传物质融合,溶源性噬菌体DNA的复制是伴随在细菌增殖下进行的。

成熟:噬菌体的成熟过程实际上是噬菌体的各部件组装过程。以T4噬菌体为例,组装过程如下:DNA分子缩合-衣壳包裹DNA形成头部-尾部装配(包括尾板装上尾管,再装上尾鞘)-头部与尾部结合-装上尾丝。

释放:噬菌体成熟后溶解酶的释放量增加,溶解宿主细胞壁,促使细胞裂解,从而释放子代噬菌体。释放出的子代噬菌体又吸附到附近的宿主细胞上,如此往复。

噬菌体的应用

1.细菌的鉴定与分型 噬菌体根据宿主的不同又可分为噬细菌体,噬放线菌体,噬蓝细菌体。也就是说,噬菌体只能侵染相应的细菌,具有高度的特异性,可以用于细菌的鉴定和分型。

2. 噬菌体展示技术和噬菌体抗体库技术 噬菌体展示技术是一种以基因表达和筛选为主要目的的分子生物学技术,其原理是将编码外源蛋白分子或多肽的基因插入到噬菌体指定的基因组中,从而在噬菌体表面与噬菌体衣壳蛋白以融合蛋白的形式展示。噬菌体抗体库技术是近几年深受研究者喜爱的一项基因工程抗体技术,其原理是用PCR(聚合酶链式反应)技术,将体外克隆抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与噬菌体载体重组,将抗体片段Fab或scFv与噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达。利用这种技术可以通过抗原-抗体特异性结合高速快效的筛选出所需要的抗体。

图3 噬菌体展示技术原理示意图

3. 致病菌的检测和控制 研究表明噬菌体能够检测和控制食品和环境中致病菌的生长。例如,给奶牛服用噬菌体制剂后再挤奶,可以利用噬菌体的宿主特异性,杀灭病原菌,减少牛奶中病原菌的污染,酸奶的制备亦是如此,噬菌体仅杀灭食源性致病菌,而不会杀发酵菌或益生菌;同样,噬菌体对食品加工的地面、墙壁和加工设备等处也能起到净化作用。噬菌体也能通过宿主特异性来检测食品中的致病菌。因此,噬菌体在食品生产、加工及检测等方面有着极大的应用前景。
       4. 畜牧业 近年来随着耐药菌问题的出现,细菌性疾病的防控也比较棘手,给国内养殖业带来困扰,加上人们对绿色环保产品的重视,是时候推出一种新的药物代替抗生素制剂。而噬菌体作为能够特异性感染不同细菌的病毒,能够安全、有效的控制细菌性疾病的发生,在细菌病治疗方面有着巨大的潜力。

5. 水产养殖 近年来,爆发性疾病的频繁发生给水产养殖业造成巨大的经济损失,因此,人们对海洋环境中噬菌体的研究兴趣日益增长,以噬菌体为微生物型指示器,在监测海洋环境,指示污染程度等方面的研究有了一些进展。噬菌体在水产养殖业的活细菌性疾病检测与治疗中有着良好的应用前景。

展望

噬菌体以其抗原谱广、高效便捷、灵敏度高等优点,在抑菌防控、细菌的鉴别筛选等许多科学领域得到广泛应用。虽然我们对噬菌体并不完美,对它的了解也还不如抗生素深刻,但我相信通过我们的努力学习,不断探寻,可以打破噬菌体应用的局限性。我们有理由相信,噬菌体技术将会在分子生物学、免疫学和医学等领域拥有更广阔的应用前景。

销售公司 | 刘俊   编审 | 祁光宇


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